利用实时荧光定量PCR 技术检测毒素基因快速鉴定A/B型肉毒梭菌方法的建立

黄英; 史芸; 叶长芸; 徐雪芳

doi:10.3784/j.issn.1003-9961.2019.09.015

引用本文: 黄英, 史芸, 叶长芸, 徐雪芳. 利用Real-time PCR 技术检测毒素基因快速鉴定A/B型肉毒梭菌方法的建立[J]. 疾病监测. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.09.015 shu

Citation: Ying Huang, Yun Shi, Changyun Ye and Xuefang Xu. Establishment of real time PCR assays for rapid detection of Clostridium botulinum type A and B[J]. Disease Surveillance. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.09.015 shu

利用实时荧光定量PCR 技术检测毒素基因快速鉴定A/B型肉毒梭菌方法的建立

黄英 ^{1

,} ,
史芸 ² ,
叶长芸 ¹ ,
徐雪芳 ^{1

,

,}

1.
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206
2.
北京化工大学材料科学与工程学院，北京 100029

作者简介: 黄英，女，北京市人，副主任技师，主要从事病原生物学和形态学研究工作，Email：Huangying@icdc.cn;

通信作者: 徐雪芳, xuxuefang@icdc.cn

摘要: 目的建立针对A/B型肉毒梭菌毒素基因的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法，构建标准曲线，评价该方法的特异性、敏感性及检测下限，以提高肉毒梭菌检测的快速性、准确性。方法根据肉毒梭菌A/B型毒素基因设计特异性引物及探针，优化反应条件，建立real-time PCR反应体系。用25种细菌评价该方法的特异性，使用含有A/B型毒素基因特异性序列的重组质粒标准品构建标准曲线，模拟粪便标本，评价建立方法的灵敏度。结果建立的real-time PCR检测方法特异性好，携带A/B型毒素基因的重组质粒均出现相应特异性扩增曲线，对其他25种细菌进行试验扩增时，均未见出现特异性扩增曲线。根据重组质粒标准品构建的标准曲线可确定其对肉毒梭菌A/B型毒素基因检测灵敏度分别为5.04×10²拷贝/μl和6.91×10²拷贝/μl。模拟粪便标本中含有目的基因重组质粒的检测下限为A型1.71×10³拷贝/μl，B型2.14×10³拷贝/μl。结论本研究设计了适合检测国内肉毒梭菌 A/B 型的引物和探针，建立 real-time PCR 快速检测体系，为我国肉毒梭菌 A/B 型菌株的快速鉴定提供一种新的技术手段。

关键词:

English

Establishment of real-time PCR assays for rapid detection of Clostridium botulinum type A and B

Ying Huang ^{1

,} ,
Yun Shi ² ,
Changyun Ye ¹ ,
Xuefang Xu ^{1

,

,}

1.
State Key Laboratory of Communicable Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
2.
College of Material Science and Engineering, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Corresponding author: Xuefang Xu, xuxuefang@icdc.cn

Received Date: 2018-10-08
Available Online: 2019-09-01

Abstract: ObjectiveTo establish real-time PCR assays for the toxin gene detections of Clostridium botulinum type A and B, construct standard curves and evaluate the specificities, sensitivities and detection thresholds of the assays, and provide evidence for the rapid and accurate detection of C. botulinum.MethodsSpecific primers and probes were designed based on the sequences of toxin genes of C. botulinum type A and B. Real-time PCR assays were established with optimized reaction conditions. 25 other intestinal bacteria and common bacteria were used to test the specificities of the assays. Standard curve construction, fecal sample simulation and sensitivity measurement were achieved with recombinant plasmids containing toxin genes of C. botulinum type A and B.ResultsThe specificities of the real-time PCR assays were high. Specific amplification curves were observed in recombinant plasmids containing toxin genes of C. botulinum type A and B. No specific amplifications were found for the 25 other bacteria. The detection thresholds of toxin genes of C. botulinum type A and type B were 5.04×10² copy/μl and 6.91×10² copy/μl respectively according to the amplification curves. The detection thresholds of recombinant plasmids containing toxin genes of C. botulinum type A and B in artificial fecal samples were 1.71×10³ copy/μl and 2.14×10³ copy/μl respectively.ConclusionIn this study, real -time PCR assays for the toxin gens detections of C. botulinum type A and type B of China were established, which can be applied in the rapid detection of C. botulinum.

Key words:

1. [1]
  Schiavo G, Matteoli M, Montecucco C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis[J]. Physiol Rev, 2000,80(2):717–766. DOI:10.1152/physrev.2000.80.2.717.
2. [2]
  Barash JR, Arnon SS. A novel strain of Clostridium botulinum that produces type B and type H botulinum toxins[J]. J Infect Dis, 2014,209(2):183–191. DOI:10.1093/infdis/jit449.
3. [3]
  王振宇, 郑翎. 我国肉毒梭菌地理分布特征的分析[J]. 中国公共卫生,1992,8(10):460–463.
  Wang ZY, Zheng L. The analysis of geographical distribution of Clostridium botulinum in China[J]. Chin J Public Health, 1992,8(10):460–463.
4. [4]
  张瑞玲, 郝杰, 罗世芝, 等. 肉毒梭菌的荧光定量PCR检测方法[J]. 农产品加工•学刊,2011(10):14–16. DOI:10.3969/jissn.1671–9646(X).2011.10.003.
  Zhang RL, Hao J, Luo SZ, et al. Detection of Clostridium botulinum by fluorescent real-time PCR method[J]. Acad Peri Farm Prod Proc, 2011(10):14–16. DOI:10.3969/jissn.1671–9646(X).2011.10.003.
5. [5]
  王春晖, 赵素慧, 韦耀, 等. A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测[J]. 中国公共卫生,2012,28(6):863–865. DOI:10.11847/zgggws-2012-28-06-59.
  Wang CH, Zhao SH, Wei Y, et al. Detection of atx gene in Clostridium botulinum using TaqMan probe FQ-PCR[J]. Chin J Public Health, 2012,28(6):863–865. DOI:10.11847/zgggws-2012-28-06-59.
6. [6]
  Satterfield BA, Stewart AF, Lew CS, et al. A quadruplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of the Clostridium botulinum toxin genes A, B, E and F[J]. J Med Microbiol, 2010,59(1):55–64. DOI:10.1099/jmm.0.012567-0.
7. [7]
  Johnson AL, McAdams-Gallagher SC, Sweeney RW. Quantitative real-time PCR for detection of neurotoxin genes of Clostridium botulinum types A, B and C in equine samples[J]. Vet J, 2014,199(1):157–161. DOI:10.1016/j.tvjl.2013.10.023.
8. [8]
  张雪平, 王荫椿. 肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展[J]. 中国生物制品学杂志,2009,22(7):728–733. DOI:10.13200/j.cjb.2009.07.101.zhangxp.022.
  Zhang XP, Wang YC. Progress in research on methods for determination of bioactivity of Clostridium botulinum toxin and pathogenic diagnosis of botulism[J]. Chin J Biol, 2009,22(7):728–733. DOI:10.13200/j.cjb.2009.07.101.zhangxp.022.
9. [9]
  Chao HY, Wang YC, Tang SS, et al. A highly sensitive immuno-polymerase chain reaction assay for Clostridium botulinum neurotoxin type A[J]. Toxicon, 2004,43(1):27–34. DOI:10.1016/j.toxicon.2003.10.013.
10. [10]
  Lindström M, Keto R, Markkula A, et al. Multiplex PCR assay for detection and identification of Clostridium botulinum types A, B, E, and F in food and fecal material[J]. Appl Environ Microbiol, 2001,67(12):5694–5699. DOI:10.1128/AEM.67.12.5694–5699.2001.
11. [11]
  雷高鹏, 杨小蓉, 黄玉兰, 等. 四川省肉毒梭菌PCR基因分型方法比较研究[J]. 中国食品卫生杂志,2017,29(4):445–449. DOI:10.13590/j.cjfh.2017.04.0110.
  Lei GP, Yang XR, Huang YL, et al. Comparative study on PCR genotyping methods of Clostridium botulinum[J]. Chin J Food Hyg, 2017,29(4):445–449. DOI:10.13590/j.cjfh.2017.04.0110.
12. [12]
  Kull S, Schulz KM, Weisemann J, et al. Isolation and functional characterization of the novel Clostridium botulinum neurotoxin A8 subtype[J]. PLoS One, 2015,10(2):e0116381. DOI:10.1371/journal.pone.0116381.
13. [13]
  Craven KE, Ferreira JL, Harrison MA, et al. Specific detection of Clostridium botulinum types A, B, E, and F using the polymerase chain reaction[J]. J AOAC Int, 2002,85(5):1025–1028.
14. [14]
  卢卫嘉, 毛晓燕, 熊颖, 等. 16S rRNA在肉毒梭菌分型鉴定中的应用[J]. 第二军医大学学报,2011,32(11):1186–1188. DOI:10.3724/SP.J.1008.2011.01186.
  Lu WJ, Mao XY, Xiong Y, et al. 16S rRNA in identification and typing of Clostridium botulinum[J]. Acad J Second Mil Med Univ, 2011,32(11):1186–1188. DOI:10.3724/SP.J.1008.2011.01186.
15. [15]
  陈会君. 奶粉中肉毒梭菌的检测［D］. 北京: 北京化工大学, 2017: 46–47.
  Chen HJ. Detection of Clostridium botulinum in milk powder［D］. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2017: 46–47.
1. [1]
  储琼芳 , 李先平 , 华玉婷 , 宋丽琼 , 肖玉春 , 黄元铭 , 朱思逸 , 任志鸿 . TaqMan实时荧光定量PCR检测艰难梭菌. 疾病监测, 2018, 33(5): 417-422. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.05.015
2. [2]
  宋杨 , 谢娜 , 邵祝军 , 周思雨 , 高源 . 金氏金杆菌特异性靶基因的选择及健康人群带菌率调查. 疾病监测, 2019, 34(2): 151-157. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.02.014
3. [3]
  李娟 , 赵丹 , 张朱佳子 , 李晓梅 , 杨帆 , 周涛 , 张合润 , 罗明 , 龚成 , 李仁清 , 李爱华 , 李茂中 , 吴疆 . 北京市急性弛缓性麻痹病例追踪管理软件应用前后关键指标质量变化. 疾病监测, 2018, 33(4): 329-332. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.04.016
4. [4]
  田国忠 , 朴东日 , 赵鸿雁 , 路殿英 , 姜海 , 王立军 . 实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的应用评价. 疾病监测, 2019, 34(5): 451-454. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.05.017
5. [5]
  刘夏阳 , 于俊峰 , 顾一心 , 梁昊 , 张茂俊 . 感染性腹泻患者弯曲菌感染的实验室检测及监测. 疾病监测, 2014, 29(5): 354-358. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2014.05.006
6. [6]
  李博 , 卢珊 , 雒涛 , 阿布力克木·阿布都热西提 , 郝琴 , 王信惠 , 张琳 , 古丽阿依·包开西 , 黎唯 . 新疆古尔图地区长尾黄鼠感染病原体情况调查. 疾病监测, 2020, 35(7): 623-626. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2020.07.015
7. [7]
  景怀琦 , 邱海燕 , 李继耀 , 肖玉春 , 崔志刚 , 顾玲 , 汪华 , 黄晓蓉 , 阚飙 , 徐建国 . 小肠结肠炎耶尔森菌O∶3血清型特异性单克隆抗体制备. 疾病监测, 2004, 19(7): 247-250. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2004.7.247
8. [8]
  邱海燕 , 王鑫 , 肖玉春 , 汪华 , 顾玲 , 景怀琦 . 小肠结肠炎耶尔森菌O:8血清型特异性单克隆抗体的制备. 疾病监测, 2007, 22(11): 730-732. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2007.11.730
9. [9]
  吉耀华 , 何蓉 , 阮强 . 沈阳地区病毒性脑炎患儿单纯疱疹病毒和柯萨奇B组病毒特异性IgM抗体的检测. 疾病监测, 2002, 17(4): 137-138. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2002.4.137
10. [10]
  陈涛 , 谢娜 , 符文慧 , 关静 . 基于实时荧光定量PCR技术检测阿克苏市健康人群脑膜炎奈瑟菌携带状况. 疾病监测, 2018, 33(1): 59-62. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2018.01.014
11. [11]
  李云芳 , 周朱瑛 , 陈秀丽 , 李光乾 . 肠道病毒71型脑炎患儿血清和脑脊液神经元特异性烯醇化酶、S-100蛋白及髓鞘碱性蛋白的测定. 疾病监测, 2016, 31(7): 571-574. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.07.009
12. [12]
  韩营营 , 段瑶 , 刁保卫 , 闫梅英 . 利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测鸭沙门菌. 疾病监测, 2019, 34(4): 307-311. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.04.007
13. [13]
  吴晓芳 , 韩建康 , 纪蕾 , 徐德顺 , 陈莉萍 , 沈月华 , 查赟峰 . 多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌. 疾病监测, 2011, 26(3): 234-237. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2011.03.022
14. [14]
  孟双 , 王艳 , 白雪梅 , 纪少博 , 李爱华 , 叶长芸 . 类志贺邻单胞菌实时荧光TaqMan PCR 快速检测体系的建立. 疾病监测, 2011, 26(11): 906-910. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2011.11.021
15. [15]
  徐敬华 . 结核病的特异性免疫诊断的研究进展. 疾病监测, 2002, 17(9): 352-356.
16. [16]
  王卫香 . 外原性哮喘76例特异性脱敏治疗初步分析. 疾病监测, 1997, 12(4): 133-135. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.1997.4.133
17. [17]
  樊粉霞 , 娄静 , 陈建才 , 聂艳妮 , 阚飙 , 闫梅英 . 利用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应方法检测血液中伤寒沙门菌. 疾病监测, 2012, 27(6): 471-474. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2012.6.016
18. [18]
  肖燕 , 任志鸿 , 樊粉霞 , 阚飙 , 祝丽玲 , 闫梅英 . 利用实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌. 疾病监测, 2013, 28(5): 407-411. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.5.020
19. [19]
  高瑞红 , 曹阳 , 闫梅英 . 基于单基因的实时荧光定量反转录-聚合酶链反应定性检测猪霍乱沙门菌. 疾病监测, 2016, 31(6): 507-511. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.06.015
20. [20]
  白雪梅 , 张少敏 , 孙晖 , 叶长芸 . 实时荧光定量聚合酶链反应检测血清2型猪链球菌的研究. 疾病监测, 2011, 26(3): 176-178. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2011.03.004

图 1 毒素A基因重组质粒标准品荧光信号图（A）及对数值-Ct值对应标准曲线（B）

Figure 1. Fluorescent graph and standard curve of type A toxin gene carrying recombinant plasmid amplified in real-time PCR assay

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 毒素B基因重组质粒标准品荧光信号图（A）及对数值-Ct值对应标准曲线（B）

Figure 2. Fluorescent graph and standard curve of type B toxin gene carrying recombinant plasmid amplified in real-time PCR assay

下载: 全尺寸图片幻灯片

表 1 实验菌株

Table 1. Strains used in this study

序号	菌名	拉丁名	菌株
1	肉毒梭菌（A、B）	Clostridium botulinum	分离菌
2	艰难梭菌	Clostridium difficile	分离菌
3	第三梭菌	Clostridium tertium	分离菌
4	产气荚膜梭菌	Clostridium perfringens	分离菌
5	索氏梭菌	Clostridium sordellii	分离菌
6	蜡样芽孢杆菌	Bacillus cereus	分离菌
7	阴沟肠杆菌	Enterobacter cloacae	分离菌
8	猪链球菌	Streptococcus suis	分离菌
9	小肠结肠耶尔森菌	Yersinia enterocxolitica	ATCC23715
10	粪肠球菌	Enterococcus faecalis	ATCC35667
11	屎肠球菌	Enterococcus faecium	分离菌
12	单增李斯特菌	Listeria monocytogenes	分离菌
13	肠出血性大肠埃希菌	Enterohemorrhagic E. coli	EDL933
14	肠致病性大肠埃希菌	Enteropathogenic E. coli	分离菌
15	肠聚集性大肠埃希菌	Enteroaggregative E. coli	分离菌
16	肠产毒性大肠埃希菌	Enterotoxigenic E. coli	分离菌
17	肠侵袭性大肠埃希菌	Enteroinvasive E. coli	分离菌
18	空肠弯曲	Campylobacter jejuni	ATCC33291
19	霍乱弧菌	Vibrio cholerae	分离菌
20	伤寒沙门菌	Salmonella typhi	H98125
21	猪霍乱沙门菌	Salmonella choleraesuis	ATCC14028
22	弗劳地枸橼酸杆菌	Citrobacter freundii	分离菌
23	阪崎肠杆菌	Enterobacter sakazakii	ATCC51329
24	福氏志贺菌	Shigella flexneri	分离菌
25	宋内志贺菌	Shigella sonnei	ATCC25931
26	金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	ATCC6538

下载: 导出CSV

表 2 引物和探针序列

Table 2. Primers and probes sequences

扩增基因	引物/探针名称	碱基序列（5′ ~ 3′）	扩增片段长度（bp）
A	F	TAA TAA AAT ATG GGT TAT TCC AGA AAG AG	111
	R	TGT TGA ATC ATA ATA TGA AAC TGG AAC T
	P	FAM-TCCTGAAGAAGGAGATTTAAATCCACCACCAG-BHQ1
B	F	CACAAACATTGCTAGTGTAACTGTTAATAA	130
	R	CTATAGTCTCATTTTCATTTAAAACTGGC
	P	JOE-CAGTAATCCAGGAGAAGTGGAGCGAAAAAAGG-BHQ2
注：F.正向引物；R. 反向引物；P. 探针